Mesure de la masse moléculaire par diffusion de la lumière statique

La description de la masse d'un atome ou d'une molécule était une question intrigante à l'aube de la science moderne. Plusieurs définitions ont été formulées, dont beaucoup sont encore utilisées aujourd'hui. Le tableau 1 résume les plus importants, ainsi que les unités auxquelles ils correspondent. Bien que les définitions et les unités soient différentes, puisque 1⁄12 de la masse de 1 mole C¹² atomes a été défini par définition comme 1 g, la masse molaire, ainsi que la masse moléculaire relative et absolue, sont numériquement identiques (1 Da = 1 g/mol).

La masse moléculaire constitue une information cruciale dans la caractérisation de base d'un certain nombre de groupes d'échantillons, tels que les protéines, les polymères ou les nanoparticules. Dans le cas des protéines, cela fournit des informations sur la stabilité physique^[A] et la structure^[B]. La masse moléculaire d'un polymère est souvent comprise comme la longueur de la chaîne et détermine des propriétés physiques telles que le point de fusion, la viscosité ou l'élasticité. Les nanoparticules sont également souvent caractérisées par leur masse moléculaire, pour étudier une possible structure en coquille-noyau, ou agrégation. Bien qu'il soit facile de calculer la masse moléculaire pour de petites particules, avec des macromolécules, telles que des protéines ou des polymères, cela devient souvent un défi. Ces molécules n'ont pas une formule uniforme dans tout leur volume, et donc différentes méthodes sont utilisées pour calculer la masse moléculaire moyenne.^[1] Cet article présente au lecteur la mesure de la masse moléculaire par le biais de la diffusion de la lumière statique et l'évaluation du graphique de Debye.

Lorsque la lumière entre en contact avec une particule, elle est contrainte de dévier d'une trajectoire rectiligne. Ce phénomène s'appelle la diffusion^[C]. Comme l'intensité de la lumière diffusée est proportionnelle au rayon de la particule, cette information peut être utilisée pour tirer une conclusion sur la taille des particules dans la dispersion. La connexion entre l’intensité de diffusion et la masse moléculaire est décrite dans l’équation de Debye-Zimm^[2], qui est la base théorique pour les mesures statiques de diffusion de la lumière : $$ {Kc \over ∆R} = {1 \over M_w P(θ) } + 2A_2 c + …$$ (1) Où c est la concentration des particules, Δ r est le rapport de Rayleigh d’un solvant de référence, K est une constante optique, M_w est la masse moléculaire moyenne en poids, P(θ) est le facteur de forme et A₂ est le 2^e coefficient du viriel. La constante optique K est par définition égale à : $$ K=4π^2 ({dn \over dc})^2 {n_0^2 \over N_A λ_0^4 } $$ (2) Où dn/dc est l’incrément de l’indice de réfraction, n₀ est l’indice de réfraction du solvant, N_A est la constante d’Avogadro et λ₀ est la longueur d’onde du faisceau incident. La route d'évaluation est différente en fonction du rapport entre la longueur d'onde et la taille des particules. Si les particules sont plus grandes qu'environ λ₀/20, le facteur de forme dépendant de l'angle P(θ) ne peut pas être négligé, et il est nécessaire de déterminer l'intensité de diffusion à plusieurs angles autour de l'échantillon. L'évaluation est ensuite effectuée à travers le graphique de Zimm, ce qui implique une double extrapolation à une concentration nulle et un angle de diffusion nul, résultant en un graphique rhomboïde caractéristique. Comme les informations angulaires sont disponibles, il est également possible d'extraire le rayon de giration (Rg). Pour les particules de dimensions inférieures à λ₀/20, le facteur de forme dépendant de l’angle peut être négligé, et l’équation de Zimm-Debye simplifie : $${Kc \over ∆R}={1 \over M_w}  +2A_2 c  $$ (3) Dans ce cas, l’évaluation est effectuée à travers le graphique de Debye qui marque Kc/Δ R sur la ou les concentration (s) Section 6). Cette approche est inhérente à la méthode de diffusion de la lumière statique, qui est expliquée en détail ci-dessous. Comme l'intensité de diffusion est uniforme autour des particules, le rayon de giration ne peut pas être déterminé à l'aide d'instruments basés sur le laser. Si le rayon de giration vous intéresse, une source de rayons X est requise (voir aussi la diffusion des rayons X à petit angle, SAXS)^[D].

Comme la détermination de la masse moléculaire nécessite une extrapolation à une concentration nulle, une série de concentrations doit être préparée et mesurée. De plus, afin de soustraire le signal de fond de diffusion du soluté, le solvant pur doit également être mesuré. Par la suite, pour situer les données mesurées sur une échelle d'intensité absolue, l'intensité de diffusion d'un diffuseur connu est également mesurée (typiquement le toluène, voir aussi la section 5.1.) masse moléculaire M_w

Le rapport de Rayleigh, ΔR, est l'intensité diffusée d'un échantillon sur une échelle absolue. Cette intensité absolue est nécessaire pour calculer la masse moléculaire absolue. Les instruments de diffusion de la lumière, cependant, ne fournissent qu'un taux de comptage sur une échelle arbitraire. Ce taux de comptage dépend des paramètres de l'instrument, tels que l'intensité du laser, l'efficacité quantique du détecteur, la taille du volume de diffusion, l'angle solide du détecteur et la précision de l'alignement. Il est impraticable de déterminer tous ces paramètres séparément, c'est pourquoi les instruments commerciaux (par exemple, le Litesizer 500 d'Anton Paar) sont calibrés en utilisant un solvant connu comme référence, le plus souvent le toluène ou le benzène. Puisque le rapport de Rayleigh (= l'intensité de diffusion absolue) du solvant de référence est connu, il est possible de définir les intensités des échantillons sur une échelle absolue.

Indice de réfraction différentiel (dn/dc) décrit le changement de l'indice de réfraction en fonction de la concentration. Cette valeur constante est caractéristique de paires de solvants de matériaux spécifiques. Bien que pour les matériaux souvent utilisés, l'augmentation de l'indice de réfraction soit accessible via des bibliothèques en ligne, pour des paires échantillon-solvant plus exotiques, une mesure supplémentaire à l'aide d'un réfractomètre avec, de préférence, la même longueur d'onde que l'instrument de diffusion de la lumière, est requise. Trouver l'augmentation correcte de l'indice de réfraction est encore compliqué par le fait que, dans le cas des polymères, la longueur de la chaîne influence également la valeur de dn/dc. La détermination soigneuse de l'augmentation de l'indice de réfraction est essentielle pour la détermination précise du poids moléculaire.

L'indice de réfraction des solvants les plus typiques est disponible dans des bibliothèques en ligne ; cependant, comme l'indice de réfraction dépend de la longueur d'onde de la source laser, il est conseillé d'utiliser un indice de réfraction qui correspond à la longueur d'onde de l'instrument de diffusion de la lumière. Litesizer 500 offre une détermination de l'indice de réfraction à la longueur d'onde exacte de la source lumineuse également utilisée pour la mesure de la diffusion de la lumière statique.

En plus de la masse moléculaire, la méthode de diffusion de la lumière statique détermine également le deuxième coefficient virial (A₂). Ce paramètre est un terme thermodynamique, qui décrit les interactions particule-solvant et particule-particule. En général, si le deuxième coefficient virial est positif, les interactions particule-solvant sont énergétiquement favorables, tandis que si le terme est négatif, les interactions particule-particule sont favorisées. Cependant, l'interprétation exacte du terme thermodynamique diffère selon les groupes d'échantillons. Dans le cas des dispersions de protéines ou de nanoparticules, le 2^ème coefficient virial peut être utilisé pour prédire l'agrégation dans différents solutés.^[4] Alors qu'une valeur négative suggère que l'agrégation est probable, une valeur positive reflète de bonnes interactions particule-solvant, et donc la stabilité. A₂ dépend de la force ionique (par ex. concentration en sel) ainsi que de la valeur du pH et de la température de la dispersion. Pour les solutions polymères, en fonction du signe du 2^ème coefficient virial, nous différencions entre les bons, les mauvais et les solvants thêta. Si A₂ est positif, cela signifie que l'interaction polymère-solvant est favorable et donc la spirale polymère va s'étendre. Au contraire, si le terme est négatif, l'interaction polymère-polymère est préférée, et donc la spirale se contracte. Si le 2^nd coefficient virial est exactement zéro, alors nous faisons référence au solvant comme un solvant thêta. Comme le 2^nd coefficient virial dépend de la température, on l'appelle aussi l'état thêta. Déterminer l'état thêta d'un système polymère-solvant est bénéfique pour une caractérisation plus approfondie de l'échantillon. Dans l'état thêta, le polymère se comporte exactement comme une chaîne idéale, ce qui facilite la détermination d'autres paramètres, tels que la distance moyenne quadratique entre les extrémités.^[5]