L'objectif de cet article wiki est d'expliquer la méthode d'indentation sur les matériaux biologiques (parfois appelée bioindentation), quels résultats la méthode donnera et quels phénomènes doivent être pris en compte afin d'obtenir des résultats corrects.
Test d’indentation sur des matières biologiques et molles à l’aide du biointenteur
Qu’est-ce que le test d’indentation instrumenté (IIT) ?
La technique d'indentation instrumentée (IIT) est disponible depuis les vingt à trente dernières années pour les mesures de dureté et d'élasticité des propriétés mécaniques locales, notamment sur les films minces. L'IIT a été intensivement utilisé dans les tests de matériaux durs, y compris des matériaux biologiques tels que la dentine ou l'os, dans des conditions sèches et humides. Depuis lors, les domaines de la biologie et du bio-ingénierie ont évolué et maintenant, la connaissance des propriétés mécaniques locales de nouveaux types de biomatériaux souples et de matériaux biologiques est requise dans de nombreuses applications. L'étape naturelle, donc, était de développer une méthode IIT également pour une utilisation dans le domaine des matériaux et tissus souples et extrêmement souples[1,2]. Cependant, l'indentation des matériaux souples a posé des défis importants, directement liés à la nature des échantillons et aux conditions d'essai :
- matériaux très doux (c'est-à-dire très conformes),
- immersion permanente dans un liquide,
- procédures de détection automatique de surface sur des échantillons avec une surface inégale
La caractérisation spatiale nécessite un système de repositionnement latéral supplémentaire approprié et un microscope optique. La procédure couramment appliquée pour l'indentation de tels matériaux comprend l'utilisation d'un indenteur sphérique (Figure 1), de faibles forces (plage de µN à mN) et de grandes profondeurs de pénétration (dizaines de µm). L'instrument doit également présenter une très bonne stabilité thermique car de nombreux matériaux montrent un comportement dépendant du temps (poroélastique, voir Figure 2). Une mesure d'indentation typique sur le cartilage utiliserait un indenteur sphérique avec un rayon de 500 µm, une charge maximale de 5 mN, un temps de chargement de 10 secondes, une période de maintien de 30 secondes et un temps de déchargement de 10 secondes.
Quels sont les principaux types de matériaux souples ?
Les principaux types de matériaux biologiques mous (d'origine humaine ou animale) comprennent le cartilage (sain ou malade), la cornée (normale ou avec traitements), les tendons et le foie. Des exemples de matériaux souples fabriqués par l'homme sont des hydrogels qui sont utilisés comme milieux de croissance cellulaire ou comme échafaudages, divers types d'échafaudages (bio-résolubles) et des microsphères. Les applications de l'indentation ne se limitent pas seulement aux biomatériaux, mais incluent de nombreux types d'autres matériaux tels que des films adhésifs pour téléphones mobiles (OCA – Adhésif Optiquement Transparent), des élastomères sans ou avec des revêtements fonctionnels (Au), et des films d'acide hyaluronique.
Figure 1 – Un exemple d'indentation sphérique.
Figure 2 – Schémas d'indentation sphérique avec illustration du flux de fluide lors de la compression locale.
Pourquoi sommes-nous intéressés par les tests d'indentation des matériaux souples ?
Le plus grand avantage de l'IIT est sa capacité à caractériser les propriétés mécaniques locales des tissus biologiques à l'échelle des (multi)couches cellulaires afin de comprendre leur comportement mécanique. Ceci est souvent fait pour trouver des matériaux de remplacement potentiels dont les propriétés et le comportement doivent correspondre de près aux tissus remplacés. Il existe de nombreuses raisons de tester localement les propriétés mécaniques des tissus biologiques mous et des biomatériaux. Voici une liste des principaux :
- De nombreux tissus biologiques sont soumis à des charges mécaniques et leur caractérisation mécanique peut donc aider au développement de tissus artificiels équivalents.
- Les changements dans les propriétés mécaniques sont souvent liés à des états pathologiques d'autres tissus et peuvent donc fournir des informations sur l'évolution de la maladie ou les effets du traitement médical.
- Les régimes nutritionnels sont connus pour affecter certains types de cartilage et entraîner des changements dans leurs propriétés mécaniques.
- Les cellules sont connues pour « ressentir » la rigidité du matériau sous-jacent et environnant et ainsi se différencier et croître dans la direction préférée[3,4]. La caractérisation des propriétés mécaniques des hydrogels utilisés pour les cultures cellulaires est donc d'un grand intérêt. En raison de son caractère local, l'IIT peut facilement sonder de petites zones dans le cartilage où une lésion a été subie et évaluer le niveau de régénération sur différents types de supports[5,6,1].
- L'IIT trouve également son utilisation dans le domaine croissant de la recherche biomimétique dans lequel la structure et les propriétés mécaniques des tissus doivent être soigneusement caractérisées pour développer des matériaux de greffe avec des propriétés aussi proches que possible des tissus réels.
Que obtenons-nous par les tests d'indentation des matériaux biologiques et des biomatériaux ?
Comme pour toute mesure mécanique, la méthode d'analyse des résultats est importante. Le logiciel d'indentation Bioindenter est conforme à la norme ISO 14577 et calcule automatiquement les paramètres d'indentation, y compris le module élastique, la dureté, le fluage, la relaxation et le travail d'indentation. Cependant, en plus de la méthode couramment utilisée pour le calcul de la dureté et du module élastique (c'est-à-dire basée sur l'approche d'Oliver et Pharr[7]), le logiciel d'indentation Bioindenter propose également le calcul du module élastique basé sur le modèle de Hertz, qui est plus approprié pour les matériaux biologiques que la norme ISO 14577. Le calcul de Hertz (Eq. 1) est effectué sur la partie de chargement de la courbe d'indentation (l'approche d'Oliver et Pharr est effectuée via l'ajustement de la partie de déchargement, voir Figure 3 : Illustration schématique du calcul ISO 14577 du module d'élasticité et de la dureté à partir de la partie de déchargement de la courbe d'indentation. hp est la profondeur d'indentation permanente après la suppression de la force d'essai., hr est la profondeur de tangente [intersection de la tangente à la courbe de déchargement avec l'axe X], S est la pente de la courbe de déchargement). D'autres types d'analyses (calculs de perméabilité, etc.) peuvent facilement être effectués sur des données exportées au format ASCII depuis le logiciel d'indentation.
Schéma 3
Figure 4 – Illustration schématique de l'ajustement de Hertz à la portion de chargement de la courbe d'indentation.
Le module d'élasticité réduit E_r est calculé selon l'équation 1 $$E_r={\sqrt{{\pi}}\cdot S\over {2 \cdot \beta \cdot \sqrt{{A_p(h_c)}}}}$$
Équation 1
où S est la pente de la courbe de déchargement, β est un facteur de correction, Ap est la surface de contact à la profondeur de contact hc. Le module d'élasticité de l'échantillon EIT est alors obtenu à partir de l'équation Eq. 2 $${1\over{E_r}}={{1-{\nu}_s^2}\over{E_{IT}}}+{{1-{\nu}_i^2}\over{E_i}}$$Équation 2
où les index s et i se réfèrent respectivement à l'échantillon et à l'indenteur. La dureté HIT est calculée à partir de la définition comme force divisée par la surface de contact en utilisant l'équation 3 $$H_{IT}={E_{IT}\over{A_p}(h_c)}$$Équation 3
L'ajustement de Hertz à la partie de chargement de la courbe d'indentation est effectué selon la Figure 4 et le calcul du module élastique est réalisé en utilisant l'Éq. 4. Cette équation inclut hdécalage, qui prend en compte la phase initiale de contact où certaines couches molles (épithélium) ou débris peuvent être présents à la surface du matériau. En utilisant l'équation 4, l'ajustement de Hertz est ensuite effectué sur la portion de la courbe de chargement qui représente le matériau lui-même.$$F={4\over3}E_r{\sqrt{R}}(h-h_{offset})^\frac{3}{2}$$
Équation 4
D'autres propriétés, telles que le fluage d'indentation ou la relaxation, peuvent également être obtenues à partir des courbes d'indentation, notamment pendant une période de maintien à une force constante (Figure 5). La formule la plus simple pour le calcul du fluage est donnée par l'équation 5 $$C_IT={{h_m-h_i}\over{h_i}}$$Équation 5
où hm est la profondeur à la fin de la période de maintien et hi est la profondeur au début de la période de maintien.
Mesures du fluage réel
Figure 5 – Un exemple de mesure de fluage sur une cornée. Notez le fluage important (augmentation de la profondeur pendant la période de maintien à une force constante).
Pour plus de détails sur la caractérisation de la poroélasticité, voir par exemple Swain et al, Hu et al, ou Kalcioglu et al dans [8–10].
Exemples de mesures sur des matériaux biologiques et des biomatériaux
Après plusieurs années d'utilisation du Bioindenter pour l'indentation de matériaux souples, les zones les plus intéressantes pour ce type de technique ont été identifiées. Ceux-ci incluent :
Cartilage
L'arthrose est l'une des maladies articulaires les plus courantes et touche environ cinquante pour cent de la population mondiale. Bien que des progrès aient été réalisés dans son traitement, une connaissance considérable est requise pour comprendre les différents mécanismes d'initiation de la maladie, les effets de la nutrition, l'avancement de la maladie et son traitement. De telles recherches sont actuellement en cours dans de nombreux laboratoires et l'un des sujets les plus brûlants est également la caractérisation des propriétés mécaniques du cartilage. La plupart de ces expériences sont réalisées sur des animaux de laboratoire, c'est-à-dire des rats ou des souris. La première phase de la recherche était concentrée sur la cartographie de la rigidité du cartilage dans des régions soumises à des charges différentes lors de la locomotion quotidienne (voir la Figure 6 pour le dispositif expérimental et la Figure 7 pour des courbes d'indentation typiques). Ces résultats des tests d'indentation aideront dans le développement et l'évaluation des traitements de l'arthrose.
Figure 6 – Configuration expérimentale pour l'indentation du cartilage de rat.
Figure 7 – Courbes d'indentation typiques de trois régions chargées différemment sur le cartilage du fémur du rat.
Régénération tissulaire
Avec le développement de structures pour la régénération des tissus et également l'augmentation de l'impression 3D de structures, des recherches ont été menées afin de comprendre le processus de reconstruction du nouveau cartilage. Une étude réalisée par Anton Paar TriTec s'est concentrée sur l'évolution de la régénération du cartilage après l'introduction de supports dans la lésion (le diamètre de la lésion était d'environ 2 mm) sur le fémur d'une chèvre. Les mesures d'indentation ont montré que le cartilage sain et régénérant présentait de grandes différences tant dans le module élastique que dans le comportement de fluage. En raison de sa résolution spéciale appropriée, l'indentation pourrait facilement mesurer la rigidité (c'est-à-dire le module élastique) du cartilage sain et du cartilage en régénération (Figure 8 et Figure 9).
Figure 8 – Courbes d'indentation obtenues sur du cartilage sain.
Figure 9 – Comparaison du module élastique du cartilage fémoral de chèvre sain et en régénération.
Cornée
Figure 10 – Courbes d'indentation typiques obtenues sur la cornée centrale, le limbe et la sclère.
La cornée, le bord cornéoscléral et la sclère représentent des régions de l'œil qui jouent un rôle important dans une vision claire. Certaines maladies ou blessures de la cornée peuvent entraîner une cécité partielle ou totale ou une douleur chronique de la surface oculaire. Les traitements de tels événements peuvent s'appuyer sur la régénération des cellules souches situées dans la région limbal. La survie et le renouvellement des cellules souches limbiques dépendent également des propriétés biomécaniques de l'environnement, c'est-à-dire de la cornée, du bord cornéoscléral et de la sclère. Il est donc important de connaître le module d'élasticité et la perméabilité du bord cornéo-scléral. De plus, certains traitements de la cornée (par exemple, le crosslinking) peuvent affecter la rigidité de la cornée et donc indiquer l'efficacité de la méthode de traitement. Une étude récente, réalisée en collaboration avec l'Université de Fribourg (DE), a montré les différences de rigidité de la cornée centrale, du limbe et de la sclère. En plus de la différence de rigidité, le fluage a également été mesuré pendant la période de maintien (voir la Figure 10). Il est clair que le fluage était beaucoup plus grand dans le limbe que dans la cornée et la sclère, indiquant une capacité plus élevée à conduire des fluides dans le limbe que dans les deux autres régions.
Hydrogels
Une série d'indentations a également été réalisée sur des hydrogels Petrisoft très doux (Matrigen Life Technologies, Brea, USA). Ces hydrogels sont fournis comme un milieu de culture avec divers modules élastiques. Tous les échantillons testés ont été fournis dans une boîte de Petri et ont été entièrement immergés dans un liquide. Leur module d'élasticité variait entre 2 kPa et 24 kPa (Figure 11). Un indenteur sphérique avec un rayon de 500 µm et une charge maximale de 50 µN a été utilisé ; la profondeur maximale dans ces conditions était de 72 µm.
Figure 11 – Comparaison des courbes d'indentation obtenues sur des hydrogels Petrisoft avec divers modules élastiques.
Que considérer lors des indentations dans les liquides et sur les matériaux biologiques
Plusieurs problèmes peuvent être rencontrés lors du processus d'indentation sur des tissus biologiques mous ou des matériaux mous. Ces phénomènes doivent être pris en compte afin qu'ils n'affectent pas négativement les mesures et ne conduisent pas à des résultats erronés.
L'effet des forces capillaires
Figure 12 – Représentation schématique des forces capillaires entre le corps de l'indenteur et le liquide.
Pour la plupart des indentations lorsque l'échantillon est en liquide, des forces capillaires peuvent être observées (voir la Figure 12). Lors de l'indentation dans un liquide, les forces capillaires sont principalement négatives mais elles dépendent de l'état de la surface, qui peut changer avec les dépôts de sel provenant de solutions salines après une immersion répétée de l'indenteur dans la solution saline. Le ménisque peut également changer son rayon à mesure que l'indenteur pénètre plus profondément dans le liquide. Sur la base de nombreuses observations, les forces capillaires lors de l'indentation sont généralement stables (l'indenteur se déplace relativement lentement) et ne perturbent pas la mesure. Cependant, les forces capillaires deviennent dominantes et peuvent être observées pendant la phase d'approche rapide précédant l'indentation.
L'effet d'une surface qui n'est pas bien définie
Dans certains cas, la courbe d'indentation montre une augmentation lente de la force au début, indiquant un contact avec un matériau très doux. Ceci est généralement observé sur des échantillons biologiques où la préparation de la surface ne peut pas toujours être parfaitement propre. Des fragments de tissu ou des résidus d'épithélium peuvent être la raison de cette phase « douce » au début de l'indentation. La Figure 14 et la Figure 15 montrent une telle indentation de manière schématique. L'effet de cette couche superficielle a été pris en compte dans l'Éq. 4 qui ignore cette phase « douce » et calcule le module élastique uniquement à partir de la portion pertinente de la courbe d'indentation.
Figure 13 – Illustration schématique de l'indentation sur la surface avec une couche « douce ».
Figure 14 – Exemple de surface « sale » ou « mal définie ».
Adhérence
Certains matériaux souples sont également enfoncés dans des conditions sèches (dans l'air). Sur ces matériaux, des phénomènes d'adhésion sont souvent observés. Les forces adhésives peuvent être enregistrées pendant la procédure d'indentation et le graphique résultant peut ressembler à celui montré dans la Figure 15. L'adhésion au tirage est enregistrée lorsque l'indenteur s'approche de la surface, tandis que l'adhésion au décollage (avec généralement des forces négatives beaucoup plus faibles en raison d'une plus grande surface de contact) est enregistrée lorsque l'indenteur est retiré de la surface. La mesure de la force de décollage minimale permet de calculer l'énergie de surface selon le modèle JKR (Éq. 6) : $$F_{JKR}={3\over 2}{\pi}RW_{12}=F_{Ad}$$
Équation 6
Figure 15 : Enregistrement typique de l'indentation sur un échantillon avec des forces adhésives.
où FJKR = FAd est la force minimale de décollage, R est le rayon de l'indentateur et W12 est l'énergie de surface pour la combinaison de matériaux donnée. Lors de l'indentation sur des échantillons avec des forces adhésives, le point de contact est généralement fixé à la force de traction minimale, bien que certains chercheurs préfèrent le fixer au point où la force croissante croise la ligne de force nulle.
Résumé
L'indentation des matériaux biologiques et des biomatériaux est un domaine très intéressant qui prend maintenant de l'importance. Bien que les méthodes de mesure semblent être bien établies, il reste encore des défis à surmonter.
